El análisis proteómico de la deficiencia de filagrina identifica las firmas moleculares características del eccema atópico

Martina S. Elias , BSc

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Heather A. Long , PhD *

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Carla F. Newman , BSc

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Paul A. Wilson , MSc

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Andrew West , PhD

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Paul J. McGill , BSc

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Keith C. Wu , MRes, BM, BCh, PhD

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Michael J. Donaldson , PhD

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Nick J. Reynolds , BSc, MBBS, MD, FRCP 

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• Referencias
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Resumen del artículo

1. Métodos
   1. Cultivo primario de queratinocitos
   2. Producción de Lentivirus (ARN de horquilla corta) y transducción de queratinocitos primarios
   3. Cultivo de LSE y extracción de proteínas
   4. Muestras de pacientes
   5. Inmunoblotting y densitometry
   6. Proteómica y análisis de datos
   7. Inmunofluorescencia
   8. RT-PCR cuantitativa
   9. análisis estadístico
2. Resultados
   1. Establecimiento de un modelo de LSE humana deficiente en FLG
   2. Diecisiete proteínas fueron significativamente reguladas diferencialmente después de la caída de FLG en piel equivalente epidérmica humana
   3. Las LSE deficientes en FLG muestran cambios de expresión consistentes con dermatosis inflamatorias
   4. La caída de FLG en LSE conduce al enriquecimiento en proteínas asociadas con el ensamblaje celular
   5. Las proteínas implicadas en las vías de señalización de estrés celular están sobrerrepresentadas en LSE después de la caída de FLG
   6. La confirmación de la proteómica da como resultado LSE independientes
   7. Replicación de los hallazgos de LSE de caída de FLG en la piel de AE
3. Discusión
5. Dato suplementario
6. Referencias

Fondo

El eccema atópico (AE) se caracteriza por una barrera cutánea y una disfunción inmune. Las mutaciones nulas en filagrina (FLG), una proteína de barrera epidérmica clave, predisponen fuertemente a AE; sin embargo, el papel preciso de la deficiencia de FLG en la patogénesis de EA permanece incompletamente entendido.

Objetivos

Intentamos identificar los cambios proteómicos globales aguas abajo de la deficiencia de FLG en modelos de piel equivalente epidérmica humana (LSE) y validar los hallazgos en la piel de los pacientes con EA.

Métodos

Proteínas expresadas diferencialmente del control emparejado (ARN de horquilla corta de control no selectivo [shNT]) y de derribo de FLG (FLG knockdown short hairpin RNA [shFLG]) se identificaron mediante análisis proteómicos (cromatografía líquida-espectrometría de masas) y el Ingenuity Pathway Analysis. La expresión de las dianas clave se validó en muestras de LSE independientes (RT-PCR cuantitativa y transferencia de Western) y en muestras de biopsia de piel normal y AE (inmunofluorescencia).

Resultados

El análisis proteómico identificó 17 ( P  ≤ 0,05) proteínas expresadas diferencialmente después de FLG desmontables, incluyendo calicreína-7 (KLK7; 2,2 veces), la ciclofilina A (PPIA; 0,9 veces), y la cofilina-1 (CFL1, 1,3 veces) . La expresión diferencial de proteínas se confirmó en shNT / shFLG LSEs; sin embargo, solo KLK7 se desreguló transcripcionalmente. Vías moleculares excesivamente después de FLG desmontables incluyen inflamación, actividad de la proteasa, la estructura celular y el estrés. Además, KLK7 (1,8 veces) y Ppia (0,65 veces) proteínas se expresaron diferencialmente en muestras de biopsia lesional de pacientes con AE con respecto a la piel normal.

Conclusiones

Por primera vez, mostramos que la pérdida de FLG en ausencia de inflamación es suficiente para alterar el nivel de expresión de proteínas relevantes para la patogénesis de AE. Estos incluyen proteínas que regulan las funciones inflamatorias, proteolíticas y citoesqueléticas. Identificamos PPIA como una nueva proteína con niveles que están disminuidos en la piel AE clínicamente activa y muestran que la regulación al alza característica de la expresión de KLK7 en pacientes con EA ocurre después de la pérdida de FLG. Es importante destacar que destacamos la desconexión entre el proteoma epidérmico y el transcriptoma, enfatizando la utilidad de los estudios proteómicos globales.

Palabras clave:

Eccema atópico , dermatitis , piel , proteómica , filagrina , calicreína-7 , ciclofilina A

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Información de cor

Proteomic analysis of filaggrin deficiency identifies molecular signatures characteristic of atopic eczema - Journal of Allergy and Clinical Immunology